Information genetique

Maintient et remodelage de l’information génétique. Comment les organismes vivants perpétuent leurs potentiels génétiques ? Pour affronter les attaques sur leurs génomes ? Pour générer de la diversité ? Importance de check points sur les mécanismes 3R de l’ADN. Qu’est ce qu’une ADN polymérase ? Enzyme qui rajoute des trinucléotides en utilisant une matrice (exception pour la terminale polymérase qui n’en utilise pas). Copie dans le sens 5’-3’. Pour initier le phénomène, il faut une amorce en bout de chaine d’ADN. Si la polymérase rajoute de nombreux trinucléotides, on l’appelle une polymérase processive, dans le cas contraire, il s’agit d’une polymérase peu processive. Une polymérase qui respectera correctement les complémentarités A-T et C-G sera une polymérase fidèle. Mais des fois, la polymérase peut mettre un C en face d’un A etc. Il existe des tests de fidélité. Mais beaucoup de ces enzymes sont également capable de défaire ce qu’elles ont fait : il s’agit d’une relecture avec une activité exonucléasique de 3’-5’. Lorsque les polymérases arrivent face a des dimères de thymines (induits sous rayonnement UV), elles s’arrêtent, incapables de reconnaitre ces dimères. Mais certaines peuvent baille-passer le problème : ce sont des polymérases translésionelles (elles sont peu fidèles). Une ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l’ADN au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de l'ADN. Il existe différentes familles de polymérases qui diffèrent selon leurs séquences en acide aminé et leurs propriétés catalytiques. Toutes les ADN polymérases synthétisent l’ADN dans le sens 5'-3' et aucune n’est capable de commencer une nouvelle chaîne sans amorces. Elles ne peuvent que rajouter des nucléotides à partir d’une amorce préexistante à l’extrémité 3’-OH. Pour cette raison l’ADN polymérase a besoin d’une amorce (ou primer), sur laquelle elle pourra ajouter de nouveaux oligonucléotides. L’amorce peut être formée d’ADN ou d’ARN et est synthétisée par une autre enzyme, appelée primase. Une enzyme, hélicase, est ensuite requise pour délier le double brin de l’ADN et ainsi faciliter l’accès des ADN polymérases sur les brins d’ADN, devenu simple brin, et permettre ainsi la réplication. Les ADN polymérases possèdent une structure très conservée. Elles sont considérées comme étant des holoenzymes puisqu’elles ont besoin d’un ion magnésium comme cofacteur pour fonctionner correctement. En absence d’ions magnésium, elles sont appelées apoenzymes. Les ADN polymérase ont la capacité de corriger les erreurs dans la formation de brin néoformé. Lorsqu'une paire de base incorrecte est reconnue, l’ADN polymérase va revenir en arrière grâce à son activité 3’-5’ exonucléase, va réinsérer la base correcte, et reprendre la réplication. Expériences de mutagénèse chez E. coli. Le mutant Pol I a une activité polymérase amoindri mais la bactérie vit très bien => paradoxe. On a ainsi découvert les différents types de polymérases chez la bactérie. Cinq ADN polymérases ont été identifiées chez les bactéries: Pol I : impliquée dans la réparation de l’ADN. Elle possède les deux activités polymérase 5'?3' et exonucléase 3'?5' (fragment de Klenow), et participe à la synthèse des fragments d’Okazaki. Elle intervient aussi en fin de réplication pour éliminer les amorces d'ARN (activité exonucléase 5'-3'). Pol II : impliquée dans la réplication de l'ADN endommagée et possède activité 5'?3' et une activité a 3'?5' exonucléase. Pol III : c’est la principale polymérase bactérienne qui intervient dans l'élongation de la chaîne d'ADN lors de la réplication au niveau du brin avancé et de la synthèse des fragments d’Okazaki. Elle est constituée de dix sous-unités. On définit une structure minimale (core enzyme ???) comprenant une sous-unité ? (activité polymérase), une sous-unité ? (exonucléase 3'? 5') et une sous-unité ? de fonction inconnue. Deux cores (???) et un complexe ? (facteur de chargement) sont maintenus ensemble par l'intermédiaire d'un connecteur, la protéine t. Pol IV : ADN polymérase de la famille Y. Pol V : ADN polymérase de la famille Y. Pour chacun des brins, il existe une synthèse continue pour l’un, et une discontinue pour l’autre (avec utilisation des fragments d’Okazaki). Chez un mutant Pol.1-, comment peut-on obtenir des mutants spécifiques de la réplication ? On va utiliser des mutants conditionnels (thermosensibles…). On a ainsi observé 2 types de mutants : -les mutants Quick Stop (QS) : arrêt immédiat de la réplication de l’ADN avec une modification de la température. -les mutants Slow Stop (SS) : arrêt lent de la réplication de l’ADN avec une modification de la température. Chez les QS : identification d’un certain nombre de gènes intervenant dans la réplication tels que Pol III (avec plusieurs sous unités), Pol II… ; et pour les SS, on a identifié des gènes codant pour des protéines impliquées dans le cycle de réplication. La polymérase I (Pol I). Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 5’-3’ (la seule qui fait ca) et donc naturellement aussi exonucléasique dans le sens 3’-5’. Peu processive. % d’erreur très faible. La polymérase III (Pol III). Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 3’-5’. Processivité importante, très dépendante de la sous unité ?. % d’erreur très faible. La vitesse de réplication chez E. coli est d’environ 1000 nucléotides/seconde. Le génome d’E. coli comporte 4Mbases. Les cœurs de la polymérase sont essentiels au phénomène de polymérisation : sous unités ?, ?, ?. Si ? est inactive, le % d’erreur est multiplié par 1000, mais la vitesse reste inchangée. La primase est importante pour les fragments d’Okazaki. Tandis que l’hélicase sépare les deux brins d’ADN. La polymérase agit sous forme d’homodimère, chaque dimère étant associée à l’un des brins. La sous unité ?, structure en anneau, homodimère, fait gagner en processivité. Le trou laissé dans l’anneau du dimère permet le passage du brin d’ADN. Fragment d’Okasaki est un terme utilisé en biologie, dans l'étude des chromosomes. Le brin « retardé » est synthétisé par petits fragments (d’environ 10 paires de bases) : les fragments d’Okasaki. L’ADN polymérase pour effectuer la synthèse d’ADN nécessite une amorce (petit fragment d’ADN ou d’ARN). Cette amorce ARN est amenée par l'enzyme ARN Primase qui est une enzyme ARN polymérase ADN dépendante. Description: Depiction of DNA replication with replication fork, strands and okazaki-fragments. a: template strands, b: leading strand, c: lagging strand, d: replication fork, e: primer, f: Okazaki fragment Entre les deux, il existe un gros complexe important : le clamp-loader qui pose l’anneau ? au bon endroit (clamp-loader = complexe ?-?). Codage : le même gène donne deux produits protéiques différents : ? et ?1. C’est un régulateur de la progression de la fourche. Ce complexe ? est important pour la fourche de réplication en agissant avec l’hélicase, qui est poussée en amont de la fourche de réplication. Le clamp-loader va déplacer une des deux sous unités ? qui va, sur le brin simple laissé (car une des deux polymérases ne peut pas synthétiser de façon continue), synthétiser le fragment d’Okazaki, puis qui sautera de quelques milliers de bases pour de nouveau synthétiser un fragment d’Okazaki etc. La primase est une ARN polymérase qui fabrique de petites amorces de ribonucléotides. La Pol I prend le relais de la Pol III pour combler le trou entre les fragments d’Okazaki. Pol I prends la suite de la polymérisation de Pol III, puis avec son activité exonucléasique détruit l’ARN pour faire de l’ADN. Il faut ensuite rétablir la continuité des brins avec la ligase. La primase est une enzyme permettant la synthèse de l'amorce d'ARN nécessaire à la synthèse du brin d'ADN au cours de la réplication de l'ADN. Les ADN polymérases permettant la réplication de l'ADN ont besoin en effet d'une petite région double-brin pour commencer la synthèse d'ADN, et cela dans les trois domaines du vivant (Archaea, eucaryotes, Bacteria). La primase des bactéries est DnaG. Chez les eucaryotes, elle est portée par le complexe ADN Polymérase ?-primase. Chez les Archaea, il existe un homologue à la primase eucaryote, mais sans équivalent à la sous-unité polymérase ?. Il est surprenant de noter que les primases d'Archaea peuvent également synthétiser de l'ADN in vitro. Il existe également chez les Archaea un homologue à la protéine DnaG des bactéries. Initiation de la réplication chez E. coli. Il existe des séquences de 13 ou 9 paires de bases à l’origine de l’oriC (origine de réplication). Rentrée en jeu d’une hélicase fabriquant une petite amorce. Phénomène de méthylation pour synthétiser les brins et éviter une autre réplication successive (la méthylation prend environ 20-30min, déterminant ainsi le temps de réplication de l’ADN et donc la division bactérienne). Les séquences Ter recrutent des protéines tus. Lorsque l’hélicase arrive dans ces séquences Ter, la protéine tus est absente, et cela permet la transcription. Fixation spécifique de tus. Ces protéines tus permettent le passage de la Pol qui arrive dans un sens, mais pas dans l’autre (utile dans le cas ou la fourche de réplication n’arrive pas à la même vitesse [car la réplication du chromosome bactérien est bidirectionnelle, et la fin de la réplication est variable sur le chromosome, en fonction de la vitesse des polymérases de chacun des deux cotés]) [La protéine tus agit comme une véritable diode moléculaire, permettant le passage des Pol dans un sens, mais pas dans l’autre]. Chez les eucaryotes : On retrouve des équivalents des mêmes structures (PCNA = équivalent des anneaux ?) [homotrimère de taille identique que l’anneau ? qui lui est un dimère] La polymérase est une ARN-ADN polymérase dépendante. Synthèse de quelques nucléotides et le reste du complexe prends en charge de l’ADN. Les fragments d’Okazaki sont plus courts que chez les bactéries. Il existe des centaines d’origine de réplication. Pour diminuer le petit fragment d’ARN entre les fragments d’Okazaki, on a les RNAses I qui coupent le petit bout de l’amorce et FEN1 qui dégrade le bout d’ADN par activité endonucléasique. Maintient et remodelage de l’information génétique. Plus l’organisme est simple, moins son ADN comporte de paires de bases. Chez les amphibiens et les insectes, il y a une grande variabilité de la quantité d’ADN. Certains insectes ont jusqu'à 100x plus d’ADN que d’autres insectes. E.coli : 4Mbases Drosophile : 100Mbases Alors, quelle est l’information contenue dans l’ADN ? Notion de complexité de l’ADN, et non plus de taille. Certains ADN seront informatifs, d’autres peu informatifs. Pour déterminer cela, on dénature puis on le fragmente. On va ensuite regarder les propriétés de renaturation. Un brin peu informatif aura beaucoup de répétitions de nucléotides. Par exemple, l’ADN ayant un poly-A aura un énorme potentiel de réassociation, contrairement a de l’ADN informatif => Il y a différente cinétique de renaturation. (Mesurable par absorption de la lumière UV par les bases : simple brin et double brin n’ont pas la même absorbance.) C : concentration de l’ADN simple brin au temps t K : constante de renaturation. Renaturation : dC/dt= -kC² On intègre entre t et t0 => C /C 0 = 1 / (1+ k C 0 t) =>... => C 0 t1/2 = 1/t Résultats : L’ADN de E. coli est beaucoup plus informatif que celui des bactériophages M32 et T4. Chez les eucaryotes, on trouve des degrés de complexité variable dans le génome, avec des séquences hautement répétées, peu répétées, ou unique. Les gènes se retrouvent majoritairement dans la zone d’ADN non répétée. Séquençages des génomes par la méthode de Sanger. Il faut séquencer x fois les génomes pour éviter les erreurs de séquençage. Génome de S. cerevisae. -eucaryote : peu d’intron (3-4% des gènes) -taille : 12Mbases sur 16 chromosomes. -codant à 72% ~6200 ORF (CDS) [peu de gènes à introns] [environ 300] Désormais, on a des techniques de séquençages plus performants Ex : méthode du shotgun Séparation des chromosomes -> clonage de grands fragments (YACs, BACs…) -> sous clonage -> séquençage -> assemblage (1) Clonage shotgun (plasmides) -> séquençage -> assemblage (2) Chez l’homme, on utilise des marqueurs CA pour faire le séquençage car les motifs CA sont répartis uniformément dans tout le génome. On peut faire des relations entre la carte phénotypique et la carte génétique d’un chromosome. La recombinaison est d’autant plus active dans les télomères que dans les centromères. La recombinaison est plus active chez la femme que chez l’homme. Plus le bras du chromosome est long, moins la recombinaison est active ADN satellite : -ADN satellite localisé : ADN de faible complexité mais répété de nombreuse fois. Peut représenter plusieurs % du génome (homme : 5-6% ; rat : >50% ; bœuf : 20%) -ADN satellite dispersé : trouvé à peu prés n’ importe où dans le génome. On distingue les microsatellites (<6 bases) des minisatellites (>6 bases) Les minisatellites : longues séquences répétées de 0.5 à 100 kb de motif unitaire de 5 à 100paires de bases. Les motifs unitaires sont très variables dans les microsatellites. 90% sont dans les régions subtélomériques. Ils sont hypervariables en lignée germinale avec des % de mutations variant de 0,5% à 13% (en principe létal dans un gène). Ils ont une fréquence de duplication intra-allélique (pour CEB1 et CEB25) Les microsatellites : courtes séquences d’environ 200 paires de bases, de motif unitaire de 1 à 6 nucléotides. 105 locis microsatellites par génome haploïde humain. Répétition de mononucléotides (A)n [34%] Répétition de dinucléotides (CA)n [19%], (GA) [5%] Conséquences moléculaire de la répétition de (A)n. Si il y a une modification du nombre de répétition au sein d’un gène, il pourra y avoir une inhibition de la transcription (cas ou la séquence 5’UTR est touchée), ou cela aboutira a une protéine tronquée (cas ou c’est dans le gène), mais aussi à un défaut d’épissage (si cela touche les séquences introniques importantes) ou encore à un ARN instable (cas ou la séquence 3’UTR est touchée). Ex : répétition de triplet (présent dans des maladies telles que la chorée de Huntington, ou encore le syndrome du X fragile) qui aboutissent à des anomalies de protéines. Ces anomalies se retrouvent donc dans la partie codante du gène. -les transposons : ADN égoïste avec une partie codante pour une transposase, avec à ses extrémité les parties nécessaires à sa transposition. Il en existe deux formes : les rétrotransposons (chez la bactérie, pas chez les eucaryotes) [on transpose avec un support ARN] et les transposons à ADN. Chez l’homme, environ 35% du génome correspond à des rétrotransposons (LINE & SINE) et 45% en comptant tous les autres types de transposons. On a pu montrer que dans certains cas, les rétrotransposons sont devenus de véritables gènes. Exemple de RAG1 et RAG2, provenant d’un rétrotransposon viral et qui maintenant code pour des protéines essentielles aux remaniements des gènes des immunoglobulines. Il ne reste donc que 20-30% codant. De plus, on trouve des duplications segmentales chez l’homme : les gènes sont très souvent présents en plusieurs exemplaires. Ces gènes peuvent évoluer de manières différentes, avec possibilités de recombinaisons extra-ectopiques entrainant des maladies. Il y a aussi le risque au laboratoire lors de l’assemblage de petits fragments. Si on additionne juste les exons, on aboutit à 1,5% du génome. Comment a-t-on découvert toutes les polymérases chez les eucaryotes ? Commenta-t-on découvert toutes les polymérases chez les eucaryotes ? -par purification de protéines. -mutations (délicat) Chez S.cerevisae, on a pu identifier 4 sous unités de la polymérase ? et leurs gènes. Il y a une sous unité catalytique et d’autres sous unités en relation avec cette sous unité catalytique mais aussi avec l’extérieur. Pour la Pol ?, on a aussi 3 sous unités. Mais on ne sait pas trop qui fait quoi… Pol ? code pour un gène ayant un certain nombre de régions conservées, des ragions caractéristiques de l’activité polymérase de 5’ vers 3’. LA délétion d’une sous unité est létale. Les polymérases se regroupent en grandes familles : Famille A : polymérases ressemblant à Pol I Famille B : polymérases ressemblant à Pol II Famille C : polymérases ressemblant à Pol III Famille D : polymérases ressemblant à Pol IV Famille Y : polymérases ressemblant à Pol V 2 hypothèses : Soit la polymérase est antérieure aux règnes des archaebactéries, bactéries et eucaryotes. Soit il y a eu des transferts d’information. On remarque en comparant les gènes que les différentes pol-?, pol-? et pol-? ont des séquences communes, et d’autres qui se sont spécialisées. Pol- ? a la particularité de tolérer une délétion partielle de la zone de polymérisation et exonucléase. La région C-ter semble être essentielle pour ne pas être létal (cependant, avec cette délétion, la cellule n’est pas en forme). Comment étudier séparément pol-? et pol-? ? On va modifier les protéines qui doivent tout de même conserver le meilleur de leurs capacités de polymérisation. On leur attache une signature. Il faudrait que cette caractéristique singulière soit une erreur spéciale faite par la polymérase pour que l’on puisse la distinguer de la forme sauvage. Ensuite, on fera des expériences In-vivo avec pol-?* - pol-? mais aussi avec pol-?, pol-?*. On fera des alignements de séquences chez les différentes espèces afin de voir les motifs conservés et afin de faire de la mutagénèse dirigée. En faisant des analogies de séquences d’acides aminés, mais aussi de structures 3D des protéines, on choisi un site à muter chez la levure (marquée par une * sur le polycopier). Imaginons que la signature soit une transversion de bases : On a donc deux moyens d’obtenir la même chose suivant que l’on touche le brin continu ou discontinu. On utilise LacZ avec un bactériophage. Si la polymérase est mutée, alors LacZ ne sera pas correctement répliqué donc ne sera pas fonctionnel : après analyse sur milieu contenant du XGal, les bactéries transfectées par le bactériophage seront blanches. Mais attention, il faut non seulement que la mutation existe mais aussi qu’elle ait un phénotype (du fait de la redondance du code, une transversion n’aboutira pas forcement à une protéine mutante avec un phénotype différent du sauvage !) Analyse des points chauds sur le gène capable de conférer un phénotype. Effet mutateur du mutant pol-? M644G. Cette mutation augmente le mésappariement des bases. Entre le WT et le mutant, on a un grand effet significatif pour les changements T-T (incapacité à détecter ces mésappariements, dans la forme WT et mutante). Cette mutation ne discrimine pas les mésappariements T-T mais se débrouille très bien avec touts les autres. Est-ce que la polymérase a un effet différent sur le brin précoce et muté ? On va intégrer cette protéine dans le vivant (levure). On ne peut donc plus utiliser la ?-galactosidase. On utilise alors le gène URA3 comme marqueur. On intègre URA3 dans le chromosome de la levure avec une Origine de réplication. En jouant sur le sens du gène, sur la place de l’origine de réplication, on peut déterminer qui est le brin précoce et le brin tardif. Dans le cadre #1, on remarque une position mutatrice avec une grosse augmentation du nombre de T. Puisque la mutation en cause est une mutation caractéristique de la pol-? et qui donne des mésappariements T-T, les résultats ne peuvent s’expliquer que par la pol-? qui es responsable du brin continu. On fait la même expérience pour la pol-? : synthèse du brin discontinu. Cependant, la pol-? est également capable de faire la synthèse du brin continu quand la pol-? est défectueuse. Translesion synthesis. (TLS) Il arrive que la polymérase soit face a quelque chose qu’elle ne connait pas (X : site abasique, dimère de thymines etc.). Avec une polymérase translésionelles, elle va associer n’importe qu’elle base en face ce site X. En général, ces polymérases translésionnelles sont mutatrices. On utilise un plasmide ayant un aminofluorène empêchant la polymérase de répliquer correctement. (=anomalie volontairement placée) sur un brin, et l’autre brin rallongé de 3 nucléotides (permettant de le reconnaitre après un Southern-Blot). Pour valider ce modèle, on fait d’abord avec les souches non mutées (sur le Southern-Blot, on voit bien que les deux brins sont synthétisés de manière coordonnée). Sur la souche mutante, on voit que les deux brins présentent des anomalies : les fourches de réplications se bloquent au niveau de la lésion rouge. Face à une lésion de ce genre, Pol III est incapable de passer au travers. On va commencer à introduire des mutants Pol II et Pol V. on peut déduire que lorsque Pol III arrive sur une lésion, elle s’arrête puis Pol II et Pol V vont avoir leur activité de polymérases translésionelles. Quand la lésion est sur la matrice servant de brin continu, on va avoir une extrusion d’une longue boucle d’ADN simple brin car l’hélicase elle, continue à avancer. (Le simple brin sera recouvert de la protéine RecA = système SOS). Si c’est sur la matrice servant au brin discontinu, le système ne sera pas bloqué mais laissera derrière lui des brins d’Okazaki non terminés. Le système SOS : =système mis en place en cas de stress. Le système fige la division cellulaire tant que le problème n’est pas résolu. L’acteur principal est RecA. Soumise a des UV, il va y avoir une transcription / traduction de certains gènes chez la bactérie qui sont en temps normal éteints par un répresseur : LexA. En cas de stress, RecA* va aller voir LexA qui s’auto-clive (LexA est une endopeptidase). Cela va entrainer la transcription de gène : immédiatement pour certains, mais plus tardivement pour d’autres : il y a des régulations subtiles dans le temps. Le système SOS sera de nouveau réprimé au bout de 30-40min par retranscription des gènes de LexA. Les gènes codés par le système SOS sont des gènes d’arrêt du cycle cellulaire. Les polymérases translésionelles n’ont pas les capacités de relecture : mutations. Le gène UmuDC (codant pour pol V) va être transcrit / traduit et sa protéine sera clivée : l’hétérotrimère umuD/umuD’/umuC va être créé. Ce complexe a des propriétés de polymérisation. Cet hétérotrimère prends le nom de Pol V. Sur le graphe, les points blancs représentent les mutants de Pol II. En cas normal, les mutants de Pol II sont comme les sauvages, et les mutants de Pol V sont beaucoup plus sensibles aux UV. Le double mutant présente un effet encore plus grave : cela laisse penser que Pol II a quand même quelque chose à voir avec la réparation. On regarde ensuite les synthèses d’ADN suite à une irradiation UV. A t0, on irradie : on met la synthèse d’ADN à l’arrêt (normal car on induit plein de lésions) mais chez le WT ca redémarre au bout de quelques minutes. Chez le mutant ?umuDC, ca s’arrête et ca redémarre plus lentement. En comparant le WT avec le mutant de la Pol B, on note que Pol B s’effondre et seulement longtemps après la synthèse d’ADN repart. Dans les conditions ou la polymérase a été inactivée par la température postérieurement à une irradiation UV, alors que le Pol III est inactive, il y a une légère synthèse d’ADN faite donc par Pol II (Pol II est transitoirement capable de faire la synthèse de quelques nucléotides puis s’arrête). Pol III arrive sur la lésion X => Re-largage par l’anneau ? => Système SOS => initiation grâce à Pol II du redémarrage de la synthèse d’ADN, sur une courte longueur (dos d’âne sur le graphique). => Réponse courte => Réplication de l’ADN => Lésions persistante => Pol V puis Pol III (30-40min pour faire la réparation de la lésion. Si pas de réparation dans ce labs de temps, il faut finir la réplication (Pol V qui passera au travers coute que coute [effets mutagènes]) Si la Pol II est absente, arrêt de la synthèse pendant 40-50min puis reprise par la Pol V : passage au travers, puis reprise par Pol III. L’anneau ? assure la continuité de la synthèse : les polymérases s’accrochent à l’anneau. Recrutement selon les besoins de la polymérase voulu. Système SOS => Gènes exprimés : -précoces : Pol II -tardifs (30-40min) : Pol V -gènes de réparation des nucléotides, des lésions. Comment identifier les polymérases translésionelles chez les eucaryotes ? Stratégie 1 : génétique classique. On part phénotype puis on retrouve les gènes. On fait des croisements, des analyses par ségrégation. Stratégie 2 : «  force brute ». On part de activité et on remonte jusqu’au gène. Purification à homogénéité à partir de cellules, micro séquençage, oligonucléotides, banque d’ADN complémentaires, banque d’ADN génomique. Stratégie 3 : complémentation in vitro. On part gène et on remonte à la protéine. Stratégie 4 : bioinformatique. On fait des recherches homologies intra ou interspécifique dans des banques. Exemple : si on prend UmuC de Pol V, on trouve des ressemblances dans tout le règne vivant. Famille des DNA polymérases Y. Région TGI (pour le système immunitaire) => Polymérase endonucléase => endonucléase coupe. => Polymérase très peu fidèle => (génération de mutants) => grande diversité des immunoglobulines. Les polymérases se sont spécialisées pour qu’il n’y a pas de redondance. Un gène est égal à une polymérase est égal à un phénotype. Sélectivité de la polymérase (bonnes bases complémentaires) Proof-Reading. Il y a ici un haut niveau de sélectivité. Il existe un troisième processus : MMR qui affute la spécificité : relecture post-réplicationnelle. Quelques chiffres : 72 000 e-5 erreurs : ½ nucléotides : normal, pas de relecture, prix a payer pour la synthèse dans seuls nucléotides. Réparation : 10 000 sites abasiques/J/cellules 50 000 coupures/jours/cellule 600 désaminations/jour/cellule 2000 lésions oxydatives/jour/cellule 5000 alkylations/jour/cellule. Classes de lésions. Déformations majeures de l’ADN : Rayonnement ultraviolet, cancérogènes (amines aromatiques, hydrocarbures, polycycliques, mycotoxines…) Modification mineure des bases nucléiques : Rayonnements ionisants Agents alkylants Désaminations, dépurinations… Pontages entre les 2 brins de l’ADN : dimères de thymines Mytocyne C Agents alkylants biofonctionnels (moutarde à l’azote) Expériences sur le modèle bactérien : Comment peut-on trouver des mutants de réparation ? En utilisant les UV : les gènes seront appelés UVR-A, UVR-B… En utilisant des rayons X : les gènes seront appelés Rad1 etc. Le paramètre important des expériences sous rayonnement UV était les conditions du jour (heure, humidité, lumière…) En effet, les chercheurs se sont aperçus qu’avec la même dose d’UV, a la même distance, pendant le même labs de temps, entrainaient des mutants différentes : les expériences n’étaient pas reproductibles. La photoréactivation est la réversion de l’allèle mutant. Les photos activent une enzyme : la photoliase qui permet la rupture des dimères de thymines : le dimère est retourné, et échangé. Ces enzymes sont très rependues dans le monde vivant. Chez les eucaryotes supérieurs, on n’arrivait pas a mettre en évidence cette activité photoliase. Ces molécules dans ces organismes ne sont plus capables de couper les liaisons covalentes entre les dimères de thymines. Désormais, elles captent les photons et l’utilisent dans la perception de la lumière extérieure et jouent un rôle dans le rythme circadien. Autres cas de réparations. Réparation d’une base modifiée. Peut se faire de manière simple : l’Oxy-6-méthylguanine-méthytransférase : un méthyle est transféré sur un acide aminé de l’enzyme. C’est la réparation par excision de bases. Principe : étape 1 : activité spécifique par une glucosylase qui retire la base erronée. Puis ( Il y a donc présence d’un site abasique) action d’une endonucléase qui enlève la séquence par coupure simple brin et la re-synthèse est assurée chez l’homme par la pol-?. Il existe deux variantes : On a juste la dégradation d ‘un petit nombre de bases: la re-synthèse se fait par Pol-? Il y a une dégradation et une re-synthèse sur une plus grande longueur avec le PCNA et Pol-?/Pol-? (SPR). La première étape est spécifique de la base modifiée. Le reste est commun aux différents motifs. Parmi les agents utilisés en chimiothérapie, il y a le TMZ qui est un agent alkylant : il introduit des méthyles sur l’ADN des cellules tumorales. Mais également sur des cellules saines. Comment faire pour ne cibler que les cellules tumorales ? On administre au patient du TMZ. Mais ces motifs seront reconnus par des déméthylases donc vont être éliminées. De plus, il y a plus de déméthylases dans les cellules tumorales que dans les cellules saines. On va utiliser les astuces suivantes : On va utiliser un analogue structural qui va saturer la méthyltransférase (qui va toucher toutes les cellules même non tumorales) Fabrication sur un plasmide d’une construction exprimant P140 (forme mutante de la méthyltransférase) qui ne sera exprimé que dans les cellules non tumorales. Réparation par exclusion de nucléotides (NER) Sur le schéma : A = produit du gène UVR-A B = produit du gène UVR-B UVR-A et UVR-B s’organisent en hétérotrimère qui va scanner l’ADN jusqu’à trouver une anomalie stérique de l’hélice (dimère de T-T, site abasique, des produits tels que le benzopyrène, le psoralène…). La reconnaissance de la lésion provoque le re-largage du dimère A et déformation de l’ADN qui forme désormais un angle de 120°-130°. La sous unité B recrute alors UVR-C (ATP-dépendant). UVR-B et UVR-C coupent maintenant en 3’ et l’autre en 5’ (sur la même chaine bien sûr) ce qui libère un oligonucléotide (~12 nucléotides) toujours apparié mais n’ayant plus de liaisons covalentes, et qui va être éliminé par UVR-D. L’ADN a donc une région simple brin de quelques nucléotides. Pour boucher ce trou, les Pol-I ou Pol-II d’E.coli vont intervenir. Expérience de Hanawalt sur l’opéron lactose. Ils y ont introduit une lésion de type T-T. L’endonucléase V du bactériophage T4 est capable de reconnaitre les dimères de T-T et de les couper. On regarde avec et sans induction par IPTG. Les constructions comportent des sites de restrictions et on utilise des sondes pour les deux brins d’ADN afin de pouvoir révéler sur gel. [Attention : lorsque le brin sera coupé, il y aura deux morceaux mais ils ne sont pas représentés sur le gel car présents tout en bas.] Sans IPTG  A t=0 on voit que la bande a disparu avec l’endonucléase V. Après t=20min, il y a une réapparition de la bande. Si 1 bande : TT persiste, si 2 bandes, TT est coupé. Avec IPTG On a un brin transcrit et l’autre non. Pour le brin non transcrit : même chose que sans IPTG. Pour le brin transcrit : la réparation à lieu à 0min mais ne persiste pas. TCR : réparation couplé à la transcription. TCR Face à un problème, la polymérase recule, aidée par le produit du gène Mfd (en N-ter, on note une forte similitude de séquences avec UV-A). Mfd recrute le NER classique (UVR-A et UVR-B). Ce qui est spécifique ici, c'est la première étape qui cible la région sur le brin transcrit. Chez les eucaryotes, c'est un peu la même chose mais les expériences qui ont été réalisées sont différentes. Les moyens d'études sont : chez la levure (mutants RAD) maladies (XP, CS, TTD) lignées cellulaires : déficiente dans la réparation d'un certain nombre de dégâts. On va complémenter ces lignées par des plasmides. On veut corriger le défaut de la lignée cellulaire. Xeroderma pigmenum => Cf diapositive. TTD => Cf diapositive. Syndrome de Cockayne=> Cf diapositive. Dans ces trois syndromes, on retrouve des gènes en commun. Il y a une diversité phénotypique sur un même gène. XPA est une molécule qui pilote la première étape de la lésion, elle recrute RPA. Le complexe recruté a déjà été identifié dans le mécanisme de transcription : c'est TF2H qui va participer à l'élimination de la lésion. Puis il y a un recrutement de XPG et XPF (ERCC1) : chacun coupe de son côté. Il y aura plus qu'à resynthétiser le brin. Chez Escherichia coli. Il y a une convergence complète : il y a une très grande amélioration du système de réparation quand il est couplé à la transcription. On recrute également TF2H. Le mécanisme de XPC fonctionne pour la voie GGR (global genom repear). Le mécanisme de CSB fonctionne pour la voie TCR (transcription coupling repear). Les deux voies de la NER. Cf diapositive. On fabrique un double brin avec du cisplatine. On regarde ensuite l'accessibilité de tout ça et la suite des événements lorsque l'anomalie sera détectée. On regarde à chacune des étapes, sur gel, les coupures qui se font. Il ne faut pas seulement regarder le nombre de bandes mais aussi leur intensité. MMR : Methyl Mismatch Repear. Principe : On détecte les anomalies consécutives à la réplication. Chez Escherichia coli : la protéine du gène MutS, agissant sous forme de dimère, signale un mésappariement, semaine change héros protéine ou puis, échange de conformation et recrute 2 protéines : MutL et MutH. Le complexe va remonter sur l'ADN des deux côtés et faire apparaître une boucle. Il faut tout à fait un système qui permet de trouver qui était le brin matrice et le brin néoformé. Chez Escherichia coli, la séquence palindromique GATC permet de savoir qui est qui. Elle est la cible d'une enzyme : la dam-méthylase qui méthyle l’adénine de la séquence GATC. Les brins seront alors hémi-méthylés, permettant de reconnaître quel brin a été néoformé. Lorsque MutS rencontrera cette séquence, elle coupera. Le brin porteur de la lésion sera coupé par une endonucléase de 5’ vers 3’, appelée Exo VII. Pol III utilisera le 3’OH comme amorce est resynthétisera le brin, enfin, il y aura action d'une ligase. La mise en œuvre de ce système n'est pas seulement liée à la réparation des mésappariements. Il peut y avoir des transferts horizontaux de l'information génétique : de l'ADN va pénétrer dans une cellule qui, a priori, ne devrait jamais le recevoir. La bactérie a mis en place un système pour voir s'il s'agit d'un ADN de la famille ou s’il s'agit d'un ADN étranger. On a alors pensé que c'est le système MMR qui permet la détection de l'ADN étranger du fait que les ADN des deux espèces se ressemblent mais présentent des variations expliquant les mésappariements. . On a pris un mutant MutL, et on a vu que la barrière d'espèces était abaissée et permettait la formation d'un hybride Escherichia coli- salmonelles. Chez les cellules eucaryotes pour Comparaison de séquence est découverte de vrais homologues entre les gènes MutL, MutS, MutH de la bactérie et chez les eucaryotes. Ces gènes chez les eucaryotes s'appellent MLH1, MSH1/2… mais pour MutH on n'a pas d'homologue chez les eucaryotes. Chez les eucaryotes : soit il n’y a qu'un seul mésappariement (système MutL?) soit il y a 2, 3 ou plusieurs mésappariements (souvent retrouvés où il y a des répétitions de bases) [système MutL?]. On a alors 2 systèmes de reconnaissance de ces erreurs. On peut retrouver la forme hybride MutL?/ MutL?. Chez les eucaryotes, aujourd'hui, on ne connaît pas le mécanisme qui permet de distinguer le brin néoformées du brin ancien, ni les enzymes endonucléases (MutM chez Escherichia coli). Pol? chez l'homme viendra resynthétiser le bout qui aura été excisé. Hereditary non polyposis colon cancer (ou HNPCC) Essentiellement due à des mutations dans MSH1 et MLH1. Il existe aussi les cassures double chaîne (DSB repear) 2 systèmes sont mis en oeuvre qui dépend un peu de l'état de la cellule: soit on remet bout à bout les extrémités des chromosomes qui ont été séparés par la cassure double brin, plus facile s’il n’y a qu'un seul chromosome. Il y a pour cela deux moyens : soit on commence par une légère dégradation des brins pour former des micros homologies permettant la ré- association. Soit on fait une synthèse de quelques nucléotides permettant la ré- association. Soit on fait intervenir un mécanisme de type recombinaison s'il y a le chromosome homologue. D'habitude, la recombinaison homologue se chez qu'en méiose, où les chromosomes homologues sont appariés via le complexe synaptonémal. Mais, en mitose, le risque de mauvais appariement est immense car les chromosomes ne sont pas associés. Pour peu que la coupure se fasse dans un gène répété, toute la recombinaison n'aboutira qu'à une translocation chromosomique pour chez les mammifères, ce système est très réprimé à cause de ses recombinaisons illégitimes (recombinaison ectopique) pour réparer ce genre de cassure. En G2, cette recombinaison est un peu plus favorisé (système HR) alors qu’en G1, c'est le système de recombinaison non homologue qui est favorisé (NHEJ). Cf polycopié pour les détails moléculaires. Où ce système de recombinaison au hasard sera utilisé uniquement de manière normale par le système NHEJ ou pour les gènes codant pour les immunoglobulines. Q 70 et Q 80 se fixent aux extrémités, et recrute la DNA-PK. Cela favorise le rapprochement physique des deux brins qui ont été séparés par la cassure et ensuite il y aura une ligation avec une perte ou non d'information génétique. Rad 50 joue un rôle essentiel : sa structure tridimensionnelle la fait ressembler un crochet. Avec MRE11 et NBS1, il y a la formation du complexe MR qui rapproche des fragments d'ADN. Un atome de zinc est présent entre les deux crochets des protéines Rad50. Si on a des mutants : Q 70 et Q 80 : on a un recollage très déficient et peu fidèle. MRN : faible efficacité mais la réparation est fidèle quand cela se passe. Ligase : très faible efficacité de ligature évidemment. Le système NHEJ est le plus important chez les eucaryotes supérieurs, pour répondre aux lésions mais aussi pour d'autres mécanismes comme la constitution du répertoire des immunoglobulines.