Biochimie CM-S4

Biochimie CM-S4 1er contrôle : 20% de la note ; ½ h 2ème contrôle : 30% de la note ; ½ h 3ème contrôle : 50% de la note ; 1 h. Représentent ¾ de la note finale. On rajoute la note de TP qui représente ¼ de la note finale. Plan : Enzymologie Rappels + mécanisme des réactions à 2 substrats Métabolisme Glucides Lipides Rappels d’enzymologie La chimie et la vie s’organisent autour de molécules carbonées. On parle alors de chimie organique. Elle est développée in vitro et n’a rien à voir avec la chimie organique cellulaire. En effet, en chimie in vitro, les concentrations, températures, pressions… n’ont rien à voir avec la vie. In vivo, il y a 3 contraintes : le solvant est l’eau (solvant aqueux, contre solvant organique in vitro) ; la température (oscille entre 30 et 40 degrés, avec une température préférée de 37 degrés, contre 0 à 200°C in vitro) ; le pH (inexistant in vitro puisque par définition, un pH se définit en milieu aqueux). Cependant, on ne peut pas faire de chimie organique dans les conditions in vivo, car les réactions seraient très lentes. Il faut donc accélérer ces réactions, grâce à des catalyseurs. La nature a développé une foultitude de catalyseurs. 100% des catalyseurs biologiques sont des enzymes. Ils prennent 1 à 2 molécules et les font réagir ensemble. Ce sont des énormes molécules globulaires solubles dans l’eau. Les Enzymes sont donc des catalyseurs biologiques qui accélèrent la vitesse de réaction chimique du métabolisme. Dans une réaction, on a toujours un équilibre, mais on a une variation d’énergie libre positive ou négative. On caractérise ces réactions par les variations de l’énergie libre. Pour une réaction chimique on a 2 approches : Thermodynamique Au départ, on a GA et GB. ?G = GB - GA ?G = ?G°’ + RTlnK R : Constante des gaz parfaits T : température absolue (Kelvin) K : Constante d’équilibre, constante thermodynamique. K = k1/k-1 = [B]eq/[A]eq accessible à l’expérimentation ?G < 0 = GB – GA < 0 = GB < GA Sens A vers B A l’équilibre, on utilise ?G°’ : ?G = 0 ?G°’= -RTlnK 6407151123950014770101790700013227051790700050038012382500 G G# 147701015430500 ?G# 17602209461500Chemin énergétique en absence d’enzyme 48895094615009163057048500643255158750062166511239500 ?G# en présence d’enzyme 1760220755650013227057556500GA Chemin réactionnel en présence d’enzyme état 209613513652500 intermédiaire (basse énergie) GB 50038010350500 Degré d’avancement de la réaction C’est la thermodynamique qui régit la chimie. Les conditions standards correspondent à 298 K, 1 atm, et tous les partenaires sont à 1 M. En biochimie, on ne peut utiliser les conditions standards, car 1 M de H donne un pH de 1. On exclu donc les protons de cette règle de 1M, ils ont une concentration de 10-7M. Approche cinétique ?G < 0 réaction spontanée de A vers B. Pour passer de A vers B, il faut fournir de l’énergie à A. Donc l’énergie libre de A va augmenter jusqu’à une énergie libre maximum, qui est un pallier appelé état de transition (de haute énergie, appelé G#). On obtient ?G#, qui est l’énergie d’activation. k = Q e-?G# / RT k est la constante de vitesse de la réaction de A vers B. ?G# important k faible ?G# peu important k important. Il faut pour ces réactions des catalyseurs biologiques, des enzymes, qui vont accélérer cette réaction, en diminuant le ?G#. Ces molécules n’ont rien à voir avec A ou B mais vont fixer transitoirement A, en modifiant sa structure, avec un très faible cout énergétique. Sur le schéma, le ?G# rouge est très inférieur au vert. Il y a un facteur d’accélération compris entre 108 et 1014. Manque 1 phrase Approche Expérimentale 2 grandeurs caractérisent une enzyme : kcat : constante de vitesse de catalyse efficacité de la catalyse KM : constante d’équilibre de dissociation, d’affinité affinité de l’enzyme pour le substrat. On parle maintenant non plus de A et de B, mais de E : concentration d’enzyme, de S : concentration en substrat, et de P : concentration en produit. ES est le complexe enzyme substrat k1 13538201212850011093457366000347980122555004241807429500E + S ES E + P k-1 v = kcat [ES] KM = (kcat + k-1) /k1 Une enzyme qui reconnaît bien son substrat a un KM le plus petit. On remarque aussi que pour une quantité d’enzyme donnée il va exister une relation en Plus les enzymes sont occupées par le substrat, plus la réaction sera rapide, jusqu’à une vitesse maximale : vmax = kcat [E]T En laboratoire, on se fixe la quantité de [E] : [E]T, et on étudie v = f ([S]). On suit en fonction de la concentration en substrat la variation de disparition de S, ou d’apparition de P, qui nous permet de reporter sur une droite v = f ([S]). Equation de Michaelis-Menten : v = vmax [S] / KM + [S] V 6432558191500 Vmax 64325529845006432552984500 105283039370006432553937000Vmax/2 64325513716000 [S] 0 KM On obtient expérimentalement vmax. On s’est fixé [E]T, donc on peut obtenir kcat. On cherche donc KM. KM = [E] [S] / [ES] KM a les dimensions d’une concentration. En plaçant vmax/2, on obtient une [S] qui est égale à KM. Cependant, on n’est pas toujours capable de faire ça, donc on utilise la représentation inverse, dite de « Lineweaver-Burk » : 1/v = 1/vmax + KM/vmax [S] y = 1/V x = 1/S 1/V 15195557556500 18719802032000 1/Vmax 1271905444500 16814809080500852805508000 Zone d’extrapolation 4718059271000 1/[S] [S] = -KM pour 1/V = 0 Le coefficient directeur de la droite obtenue est égal à 1/vmax, donc la tangente de ce coefficient vaut KM/vmax. On peut utiliser KM comme si c’était une concentration. Pour que l’enzyme reconnaisse le substrat, il faut qu’elle donne un complexe ES, pour donner le produit. Il faut donc qu’il y ait reconnaissance entre l’enzyme et le substrat, ce qui se fait dans le site catalytiques. Il faut donc une chimie de transformation de S qui va l’amener à un état intermédiaire, avant de devenir P. Le site catalytique prend en charge la molécule de S à travers des interactions chimiques, entre S et les chaines latérales des acides aminés du site catalytique. Or les enzymes ne sont constituées qu’à partir de 20 acides aminés (hydrophobes, polaires et chargés). Ce qui autorise des interactions hydrophobes, hydrogènes, électrostatiques. Mais ils n’ont pas les capacités suffisantes pour assurer toutes les transformations de S, donc l’évolution a développé des auxiliaires chimiques, appelés coenzymes. Ce sont des petites molécules organiques qui vont apporter une aide : les coenzymes d’oxydoréduction ou les coenzymes de transfert de groupe. Les coenzymes peuvent être soit fixés en permanence sur l’enzyme (liaison covalente), soit s’y fixer de façon transitoire. Une hiérarchie se met en place, car c’est comme une réaction à 2 substrats. Les organismes supérieurs ne sont pas capables de synthétiser les coenzymes. Ils sont donc apportés par l’alimentation, sous la forme de vitamines. Ce sont des vitamines apportés par des bactéries sur les aliments. Une carence en vitamines conduit à la mort. Dans la réaction qui se développe au niveau du foie : Alcool déshydrogénase 908685100330006642105270500CH3CH2OH CH3COH + 2 e- + 2 H+ éthanol acétaldéhyde L’alcool déshydrogénase seul ne peut accepter d’électrons, puisqu’il est constitué des 20 acides aminés de base. Il lui faut donc un accepteur d’électrons : le NAD (Nicotinamide adénine dinucléotide). Le coenzyme nicotinique contient le NAD. Voir feuille annexe 1 c) Il y a des restrictions sur le site actif : 1ère restriction : enzymes michaelliennes 2nde restriction : réaction à 1 substrat Mécanisme des réactions enzymatiques à 2 substrats. Principes généraux 1 Enzyme au sein d’une restriction peut fixer 2 molécules. On appelle les 2 substrats A et B. Les produits sont P et Q. 42608523431500Chemin réactionnel : 338645515748000307848015748000162687015748000125857015748000 A B P Q 20720051009650072707510096500 EAB EPQ 7270759779000 E E 338645511811000307848011811000162687011811000125857011811000 B A Q P Il existe 3 mécanismes de réaction enzymatique à 2 substrats : Mécanisme bi-bi aléatoire Le plus général : la fixation de A ou de B sur l’Enzyme est aléatoire. Mécanisme bi-bi ordonné  Etablissement d’une hiérarchie entre les 2 enzymes ou 1 enzyme et 1 coenzyme qui établit l’ordre entre A et B : exemple : réaction impliquant des coenzymes). Mécanisme Ping Pong A devient P, B devient Q. Réactions enzymatiques à 2 substrats Glucose + ATP glucose 6 P + ADP Hexokinase et glucokinase Enzyme monomérique, un seul site catalytique, une seule chaine peptidique, v = f([S]) branche d’hyperbole. Différencie les enzymes michaelliennes des autres. Enzyme à 2 substrats : on cherche à déterminer d’un point de vue expérimental le KM. On aura 2 constantes d’affinité, puisque 2 substrats, et 2 kcat, qui représentent l’efficacité globale de la catalyse. Formalisme mathématique : 1/v = f([1/S1, 1/S2]) conduisent à la représentation expérimentale : détermination de KS1, KS2, kcat. Dans le mécanisme aléatoire, il n’y a pas de hiérarchie. Mais dans le mécanisme ordonné, il y a hiérarchie, un substrat se fixe le premier et part le dernier. L’expérience se fait en sens inverse, on fait d’abord la représentation expérimentale, avant le formalisme mécanique. Le mécanisme aléatoire E : enzyme A : premier substrat P B : deuxième substrat Q 42608523495000Représentation simplifiée de l’évolution de la réaction : 338645515748000307848015748000162687015748000125857015748000 A B P Q 20720051009650072707510096500 EAB EPQ 7270759779000 E E 338645511811000307848011811000162687011811000125857011811000 B A Q P Si A est déjà fixé sur l’enzyme, B ne va pas se fixer de la même façon, avec la même efficacité que sans A. Il faut déterminer les constantes d’affinité, constantes de dissociation. KM : constante d’affinité = constante de dissociation du complexe Enzyme-Substrat. 1/v = f (1/[A], 1/[B]) KA, KB, kcat 548005457200015424151123950086233011239500 KA EA K’B 17678408953500A B 2072005762000015424151428750086233014287500 E EAB Kcat E + P + Q 176720528575005480059588500B A KB EB K’A La plupart du temps, K’B est différent de KB, car la fixation de A peut changer la conformation de l’enzyme. De la même façon, KA est différent de K’A. On peut donc définir les constantes de différenciation suivantes : KA = ([E][A])/[EA] KB = ([E][B])/[EB] K’A = ([A][EB])/[EAB] K’B = ([B][EA])/[EAB] KAK’B = K’AKB Expression de la vitesse de la réaction enzymatique de façon à exploiter des données expérimentales en représentation de Lineweaver-Bürk : 1/v = 1/vmax [1 + (K’A/[A]) + (K’B/[B]) + (K’AK’B/[A][B])] Cette équation est symétrique par rapport à A et à B. Il n’y a pas d’importance privilégiée. L’un ou l’autre se fixe le premier, l’incidence de A ou de B est la même. On fait 2 séries d’expériences. On étudie d’abord 1/v = f (1/[A]), pour certaines valeurs de B. Puis on étudie 1/v = f (1/[B]), pour certaines valeurs de A. En faisant les fonctions, on obtient des droites. La concentration de B va avoir une incidence sur la pente de la droite. On obtient des droites sécantes, puisque B affecte le coefficient directeur de 1/V=f(1/[A]), en un point d’abscisse extrapolée [A]=-KA, et d’ordonnée 1/v = 1/vmax [1-K’A/KA] 271970519812000Représentation correspondante : 1567180717550015671807175500 1/V [B] croissant 15671806985001117609334500 50801016000 2814955190500015690857556500587375125730001567180190500050807556500 1/Vmax Conditions saturantes en [B] 508012700000 1/[A] -1/KA Pour obtenir 1/vmax, on va prendre la droite dont la pente est la plus faible. C’est la droite obtenue pour la concentration maximale de B. On appelle cette concentration la concentration saturante. Ce sont les conditions saturantes en [B]. [B]>KB. On extrapole à 1/[A]=0 [A]=+l’infini 1/v=1/vmax. Dans l’exemple : 1/v = 1/vmax [1-K’A/KA]>0 1-K’A/KA >0 1>K’A/KA K’A>[B] Incidence sur la valeur de la vitesse de la réaction 2ème situation : [B]>>[A] On raisonne par rapport à KA et à KB. 1/v = 1/vmax [1+KA/[A]] x KB/[B] + 1/vmax 256730543180001ère situation : [B]<<[A] [A] = 10KA 1/v = 1/vmax [1+1/10]x10 + 1/vmax [B] = KB/10 = 1/vmax [11/10]x10 + 1/vmax = 12/vmax v = vmax/12 295783063500002ème situation : [A]