Replication ADN

Initiation de la réplication de l’ADN. Chez les procaryotes : Modèle d’E.coli (F. Jacob) Chez S.cerevisae : Il y a-t-il des séquences spécifiques qui initient la réplication ? Y existe-t-il une séquence autonome de réplication ? Ils ont fragmenté l’ADN de la levure et ont fait plusieurs inserts dans des plasmides. S’il y a prolifération, cela veut dire que la séquence ADN insérée était une origine/séquence de réplication. Cartographie des origines. Lorsque l’on digère l’ADN par des nucléases, on va obtenir des fragments avec des bulles de réplication, d’autres avec des formes en X et d’autres en Y. Résolution des topologies de la fourche de réplication. Principe du gel à 2D. La première séparation se fait uniquement en fonction de la masse (les molécules les plus petites migrent le plus rapidement). On tourne alors le gel à 90° : 2e migration qui aura deux contraintes : la masse et la topologie de la molécule. (On peut observer un retour d’une molécule quasi-linéaire pour la forme en Y). Pour la forme « bulle de réplication », on observe un arc parfait sans retour. Pour la forme en X, le profil de migration est assez linéaire. ARS : origine de réplication ? L’insertion des ARS est bordée par des sites de restrictions dans le plasmide. Si cet ARS est une origine de réplication, il va se forme une bulle, ou forme en X / Y, et après digestion, on fait migrer sur un gel en 2D. On observe un retour dans la migration, donc c’est une forme en Y, donc l’ARS était bien une origine de réplication. Test aussi a différents temps, ce qui nous donnera les formes en X et une bulle de réplication. Activité des ARS in situ. Les cas précédents étaient des cas idéaux. Il se peut que l’ARS se trouve en bord du fragment coupé par les enzymes de restriction : on observera avec le temps des mélanges de formes. Il se peut également que plusieurs ARS soient voisins avec l’une active et l’autre inactive. Etudes des ARS au niveau du génome. Sur le chromosome 6, on remarque que seuls les ARS 603, 606 et 607 sont actives. Alors que la 604 et 608 sont inactives. Pour 606 et 607, qui sont voisines, on va avoir une des deux qui sera plus actives que l’autre. 606 est active mais on remarque une forme en Y plus faible car 606 est parcouru par une fourche de réplication. Phénomène également présent pour 603 (parcourue par la fourche de réplication de 604). Cartographie des origines. On cultive les cellules sur un milieu lourd. On les synchronise avec le facteur ? pour toutes les mettre en début de phase S. Puis elles seront cultivées ensuite sur un milieu contenant des isotopes légers. Digestion de l’ADN à différents temps de G1 et de S puis migration sur gradient de ClCs. Ainsi, on peut isoler l’ADN répliqué de l’ADN non répliqué (on sait ainsi si la séquence contient une ARS ou pas). Techniques des puces à ADN. On synthétise in vitro des séquences d’ADN qu’un robot dépose sur une plaque en verre. Une autre entreprise synthétise directement les séquences sur une plaque de verre. Sur la puce, il y a environ 24 000 locis, et l’on trouve tout le génome de S.cerevisae. On prélève l’ADN répliqué, lors de la migration sur ClCs, dans lequel on trouve le fragment 2. Avec un fluorochrome que l’on couple a la séquence 2, on hybride ces fragments sur la puce après avoir dénaturé les ADN de la puce et du tube. Au temps t0, la seule hybridation possible se fera en position 2 sur la puce (en t1 ; on a juste une petite bulle de réplication). En t2, la fourche de réplication a progressé donc les régions 1 et 3 seront aussi répliquées. Les fragments se retrouvent tous a la surface lors de la migration sur gradient de ClCs. On aura alors une hybridation sur les spots 1, 2, 3 sur la puce à ADN. Immunoprécipitation de la chromatine. Les complexes protéiques se fixent sur l’ARS. On fragmente l’ADN donc certains fragments auront des protéines, et d’autres non. On utilise alors un Ac qui va retenir tous les fragments portant un complexe d’initiation. Après lavage, on récupère les fragments 2 que l’on va marquer ainsi par un fluorochrome. On l’hybride sur la puce à ADN (on amplifie tout le même ADN décroché de la résine qui est un marqueur par PCR). Avec cette méthode, on observe 429 ori, contre 332 avec le gradient de ClCs. Cette méthode est controversée car ce n’est pas parce qu’un complexe protéique se fixe qu’il s’agit d’une origine de réplication. 3e méthode : méthode du nombre de copie : plus il y a de copie, plus l’intensité du spot sur la puce sera importante, montrant les zones qui se sont répliquée. Avec cette méthode, on obtient 247 ori de réplication. Après avoir fait un comparatif des 3 méthodes, ils ont trouvés 168 ori de réplications communes. Recherche d’ARS HFT => milieu sélectif. Stabilité mitotique => milieu sélectif => milieu non sélectif. Origine de réplications : éléments modulaires S’il n'y a pas de boîtes A alors il n'y aura pas de réplication. Sur d'autres plasmides, ils ont modifié cette séquence : en certaines positions on ne change pas la vitesse de pertes, mais pour d'autres, on a une variabilité possible. Il y a des cas ou aussi la cellule ne pousse plus. Il reste des positions invariables (comme les positions 3, 5, 8, 9, 10). Il compare alors la séquence de cette ARS 307 avec d'autres ARS. On note des variabilités (positions 3, 5, 9, 10) On retrouve une boîte A dans chaque ARS : séquence consensus qui peut varier entre les ARS. Composition de la séquence ARS. (Ci-dessus) Boîte B. L’ARS avec la boîte A a été clonée dans un plasmide. Action d'une nucléase. Si on la fait agir peu de temps, il y a une faible digestion. Les digestions se font par une enzyme de restriction Hind III (ronge de 3’ en 5’) et EcoR I (de 5’ en 3’). Le fait donc agir à différents temps et on fait une ligation pour fermer le plasmide. Obtention de banque avec des ARS de différentes tailles. On mesure la taille qu'il reste de l’ARS. On fusionne la partie 5’ de l’ARS avec un fragment plus petit pour retrouver la taille normale de l’ARS (Pareil avec les parties 3’). Le linker va se retrouver à différentes positions de l’ARS (certaines séquences ont été remplacées). Le linker est une séquence qui n'a rien à voir avec l’ARS. Pour, on fait une transformation et culture sur un milieu sélectif. Si le linker est situé sur la boîte A, L’ARS n'est plus fonctionnelle, contrairement aux autres sites. On a eu une diminution de l'efficacité de transformation. On fait la même manipulation pour le test de stabilité mitotique sauf que les milieux sont différents. Quand le linker est à la place de la boîte A, les levures ont perdu leur plasmide. L’ARS est non fonctionnelle. On remarque qu'à trois autres endroits le plasmide n'est plus maintenu : B1, B2, B3. Ils ont fait des substitutions de séquence entre les ARS1 et 307. Il y a une variation de stabilité en fonction des substitutions des boîtes. On peut donc échanger les boîtes mais il faut que B1 reste à la même position de l’ARS correspondante. Étude de l’ARS 305 par linker scanning. Elle possède une boîte B1 et B4. On échange de nouveau les boîtes entre les ARS 305 et 1. Conclusion : ARS présente une séquence consensus de toujours 11 paires de bases. La boîte A sert de liaison ou complexe d'initiation qui reconnaît l'origine de réplication. Pour la boîte B, aucune homologie de séquence mais on peut en remplacer ! Origine de réplication chez les eucaryotes. On fait une banque de plasmide : on note des séquences de 800 à 1000 paires de bases qui permettent la réplication du plasmide de façon autonome. On ne trouve pas de séquence consensus chez Saccaromyces pombe. Chez les eucaryotes supérieurs, aucune séquence trouvé pour que le plasmide se réplique de façon autonome. Technique des brins naissant. On extrait de l'ADN hégémonique que l'on porte à 100 °C (détachement des brins naissants) et cela génère aussi des fragments simples brins. On fait alors un gradient de sucrose où l'on aura une répartition des fragments de différentes tailles. On s'intéresse aux fragments entre 0,5 et 2 kilos bases. (Phase ayant les brins naissants). On fait alors une digestion d'ADN de 5’ en 3’ (digestions réalisées par la ?-nucléase) mais elle sera bloquée quand elle veut digérer les brins naissants. On aura alors plus que les brins d’ARN amorces. On fait ensuite une PCR après purification des brins naissants. Là où il y aura une PCR, cela voudra dire qu'il aura eu le primer qui s’hybride avec l’ARN, donc on pourra repérer la partie qui nous intéresse, donc c'est une origine de réplication. Ainsi, 20 origines de réplication ont été trouvées. Parmi elles, 20 % de l'activité est assurée par l'origine ?. Autre méthode. On synchronise les cellules en phase G1/S. Puis on les laisse repartir. Une fois après les deux premières heures, on met du BrdU qui s'incorpore. On marque ainsi l'ADN néosynthétisé. Puis ensuite, il y a une digestion enzymatique puis la séparation sur gradient de ClCs (chlorure de césium) auquel on rajoute un fluorochrome. Puis on laisse incorporer après dix heures. On refait un gradient et l'on marque la fraction avec un autre fluorochrome (de couleur verte cette fois, représentant tout le génome). On mélange alors les deux produits, on dénature puis on hybride sur une puce. On doit donc avoir le signal vert sur toute cette puce. L'ADN répliqué pendant deux heures (rouge) va s'hybrider à certains endroits. On détermine ainsi les zones où il y a des origines de réplication. Complète initiation Initiation et purification d'origine de réplication : ORC (origin recognition complex) On purifie les cellules, et on extrait les protéines nucléaires contenant différents types de protéines qui se lient à l'ADN. On s'est un fractionnement de ses protéines (c'est ainsi que l'on isole les protéines qui se lient à l'ADN). On utilise ensuite une colonne d'affinité : on construit cette colonne avec toujours de l’éosine et contenant la boîte A. chaque fraction obtenue après la première séparation va être isolée indépendamment. On espère que les protéines ayant de l'affinité avec la boîte A reste dans la colonne. On fait une élution ensuite par des solutions en sels de concentration croissante pour récupérer ces protéines. Ensuite, on fait un gradient de glycérol pour séparer ces protéines de manière plus résolutive. On mélange alors l'ADN double brin marqué contenant l’ARS1 avec les fractions. On fait une digestion ménagée avec la DNAse I. Schéma : la fixation du complexe va empêcher la formation de certains produits de digestion. Chez la fraction 18, il y a eu une protection de la boîte A et peut-être aussi de la boîte B1. Il faut migrer cette fraction sur gel de polyaccrilamide et ont identifié 6 protéines : ce complexe a été appelé ORC. Origine de réplication : éléments modulaires. Étude par linker scanning. On met le linker à côté de la boîte A, dans la boîte A... Si on utilise un linker à côté de la boîte A : la séquence est toujours protégée de la DNAse I. Si on utilise un linker dans la boîte A : il y a des coupures sur la boîte B1 et A. le fait de changer certains nucléotides sur la boîte A a une influence sur les coupures de cette boîte. Teste de la protection à la DNAse in vivo. Transformation d'un plasmide contenant une ARS. Le complexe fixé empêchera certaines coupures mais il faut maintenant savoir les lieux de coup de pouce : extension d'amorces. On choisit une petite séquence marquée radioactivement capable de s’hybrider au niveau de l’ARS. L'amorce va synthétiser le brin complémentaire mais s'arrêtera à la coupure. On récupère toutes les expansions que l'on fait migrer sur un gel et on fait une autoradiographie. Comparaison in vivo & in vitro. In vivo, la fixation de protéines est plus importante : d'autres protéines doivent se fixer à des endroits différents. Fixation des ORC pendant le cycle. On fait la même expérience sauf que l’on synchronise les cellules. Le complexe ORC se fixe sur la boîte A tout au long du cycle. En mitose, ORC est fixé. On observe un changement en G1 : B1 est protégée, non ou peu en mitose. [NOC : mitose] [Peptide ? : G1] Passage du complexe pré-réplicatif au complexe post-réplicatif. Complexe pré-réplicatif : B1 est protégé. Complexe post-réplicatif : il y a une coupure en B1. Les phénomènes sont inversés en G1 et en mitose. Si on avait une origine tardive, cela aurait décalé les transitions. Quels sont les autres composants des complexes initiations ? Étude de mutants ORC. Orc2-1 : à 37 degrés : perte de l'initiation au niveau de l’ARS1. Orc5-1 : à 37 degrés : plus initiation au niveau de l’ARS1 puis on laisse plus longtemps si il n'y a plus de réplication. Ces protéines sont essentielles pour l'initiation. À partir du mutant Orc5, on a voulu chercher des mutants suppresseurs. Les expériences utilisées sont les mêmes que précédemment vues : fabrication de banque d'ADN complémentaires, transformation de cellules de levure par ces plasmides... Après analyse des plasmides qui survivent : le gène Orc5 époux mais aussi d'autres plasmides présentaient le gène Cdc6. Mise en évidence de Cdc6. Le phénotype Orc5-1 est supprimé par la surexpression de Cdc6. Cdc6 est-elle une protéine du complexe initiation ? On remarque que Cdc6 interagit avec Orc5. Mise en évidence de Cdc6. Chez cette levure, on peut réguler l'expression de CDC 6 par le promoteur Met3. A t=0, on a bien le complexe post-réplicatif (coupures en B1) Avec Cdc6 (-Met) : au bout de 30 minutes, on passe du complexe post-réplicatif au complexe pré-réplicatif observé au bout de 60 minutes. Le blocage initial se fait en anaphase. Sans Cdc6 (avec Met) : pas de transcription de Cdc6. A t=0, 30 minutes, 60 minutes : toujours le complexe post-réplicatif. Cdc6 vient peut-être habituellement se fixer à ORC (sans méthionine) et protégé la boîte B1, ce qui prouve que CDC6 fait parti du complexe d'initiation. Découverte des MCM (Minichromosome maintenance défective) Minichromosome = plasmide On veut isoler des levures qui ont des protéines pour le maintien du plasmide. Transformation puis mutation par EMS (agent alkylant). Caractérisation des mutants MCM : on attend 10 % de survivants. On s'intéresse alors ou génotype de chaque levure avec teste de stabilité mitotique. Chez la levure WT : 50 % portent le plasmide dont les mutants portants le plasmide s'élève à 10 % d'entre elles. (Donc il y a 90 % de pertes). Quarante mutants ont été isolés et 16 groupes de complémentations ont été obtenu (des mutants ont été appelés mcm1…) Étude des mutants mcm1 et mcm2. On a une accumulation des cellules en phase S. C'est le même phénotype que chez des mutants Cdc. Correction de la question quatre du TD réplication 1. Complexes de pré-réplication et post-réplication Complexes de pré-réplication : ORC & Cdc6 Complexes de post-réplication : ORC Une autre équipe a fait des mutagénèses avec EMS. Et ils s'intéressent directement au phénotype Cdc. Il constate un arrêt CDC des cellules en phase S à 38 degrés avec une instabilité mitotique. Isolement du gène par complémentation. Banque de plasmides => transformations => sélection des levures => isolement des suppresseurs de phénotype arrêt de phase S. Isolement des gènes Mcm 2, 3, 4, 5. Homologie de séquence des protéines mcm. On trouve un abdomen de utile sont communs à l’ATP. On ne peut pas échanger une protéine ou gène mcm avec un autre. Sur le schéma, en gris clair : homologie des séquences avec les eucaryotes supérieurs. Recrutement des mcm sur la chromatine. En mitose, on n'a pas de Mcm7 sur la chromatine. Ils ne sont recrutés qu'en phase G1. On fait une co-imunoprécipitaion de la chromatine pour savoir à quel endroit de la chromatine se fixent les protéines. La réversion de pontage (agent dénaturant) va permettre la modification tridimensionnelle des protéines, qui vont se détacher de l'ADN. On récupère l'ADN double bras. On fait une PCR avec des amorces et on regarde si oui ou non on a une amplification. Complexes pré-réplicatif : ORC & Cdc6 <==== Mcm peuvent s’y fixer. Découverte de Cdt1. Chez la levure. On observe une accumulation de cellules en phase G1 dont le milieu en présence de thiamine. Elles ont le même phénotype que Cdt1. Le recrutement de Mcm4 est très affecté. Pour Cdc6, il y ajuste une légère diminution. Pour que les Mcm soient recrutées sur la chromatine, il faut du Cdt1. Découverte de Cdc45. Ce gène intervient au niveau du complexe initial. En croissant ORC avec Cdc25, les cellules sont létales. Hypothèse : Cdc45 intervient dans l'initiation de la réplication de l'ADN. Initiation de la réplication de l'ADN au niveau de l’ARS1. Cdc45 intervient dans l'initiation de la réplication mise en évidence par gel à deux dimensions. Recrutement de Cdc45 et Mcm. Ils font des co-imunoprécipitaion de la chromatine. En G1 : Cdc45 se lie sur l’ARS1 et 305. En G2/M : Cdc45 intervient pas sur l’ARS1 et 305. Recherche de protéines par simple hybride. Étape numéro 1 : on construit une banque et ont fragmente en très petits morceaux l'ADN. On peut placer le gène dans le même cadre de lecture et proche du gène Gal4 qui servira d’activateur. Étape numéro 2 : activation. Cf polycopiés. On regarde les colonies bleues car celles-ci auront été transformées et auront exprimées une protéine capable de se lier à l’ARS de manière directe ou indirecte. Puis on analyse la séquence codante. Ils ont isolé cinq clones correspondant à DBF4 Découverte de Cdc7-DBF4. Chez le double mutant mcm2-1 DBF4-6, on retrouve une initiation de la réplication à 38 degrés : DBF4-6 restaure l'initiation de la réplication. Cette kinase interviendrait dans la régulation des mcm. Chez le système xénope. On passe un extrait cellulaire sur une colonne qui permet de capter Cdc7. On récupère les protéines qui sont passées (c'est-à-dire toutes les protéines excepté Cdc7 qui est restée accrochée à la colonne) : c'est une déplétion. On mélange cet extrait à l'ADN, on centrifuge, on élimine le surnageant, on sépare les protéines collées à l'ADN puis on fait un western Blot. On observe que dans l'extrait déplété, Cdc7 et Cdc45 ne se fixent plus à la chromatine. Rôle des CDK (Cyclines dépendantes kinases). Cf polycopié : rôle de la kinase Cdc28-Clb5,6. Le complexe mcm peut former un anneau capable d'encercler de l'ADN simple brin. En note une activité hélicase pour mcm3, 4 & 7. (Activité très faible) : ce sont les hélicases de la réplication. Le complexe avec les six sous unités n'a aucune activité hélicases. Cdc45 aurait un lien avec le complexe mcm et serait le signal de recrutement pour les polymérases... Après la phosphorylation, il y a une réorganisation du complexe d’initiation en phase S. On passe alors au complexe post-réplicatif avec l'activité hélicase. On retrouve exactement les mêmes protéines chez les eucaryotes supérieurs, avec les mêmes séquences (importantes homologies) ce qu'il n'y a pas d’ARS. Cdc28-Cln = Cdk2-CycA chez les eucaryotes. Cdc7-Dbf4 = cdk2-CycE chez les eucaryotes.