Biochimie-peptides

Les Peptides Peptides: composés naturels ou synthétiques issus de l'enchaînement limités d'AA entre eux par liaisons covalentes: les liaisons peptidiques. Ce sont donc des polymères composés de monomères, les AA. Si le nombre d'AA ? 10 = oligopeptide 10 ? AA ? 100 = polypeptide AA ? 100 = protéine. 1. La liaison peptidique Fonction de cette liaison Géométrie de la liaison Cette liaison existe sous forme d'un mélange en équilibre de 2 formes mésomères. Forme mésomère: forme développée de même composé différent par la nature de la disposition des liaisons entre les atomes consécutifs. La liaison peptidique n'est pas stable, elle vacille entre deux formes; O et N se partagent les électrons. Cependant il s'agit d'une liaison très stable, dite « stabilité par résonance ». Par ailleurs, cette disposition électroniques au niveau de la liaison peptidique, entraîne l'impossibilité d'une rotation autour de la liaison C-N. Cela définit un plan comportant 6 atomes. En revanche, les Carbones alpha sont en « trans » par rapport à la liaison C-N, ce qui définit une ligne brisée. 2. Structure primaire des peptides Nommer un peptide On commence à nommer le 1er AA (en N-terminal) en ajoutant le suffixe « yl », puis on nomme les suivants dans l'ordre, tous porteurs de ce même suffixe. On termine par l'AA en C-terminal sans suffixe. Ex: N-ter Gly – Ser – Val – Asn C-ter 4- Glycyl – Seryl – Valyl – Asparagine Pour les oligopeptides, on rajoute un préfixe désignant le nombre d'AA qui le composent. Distinguer composition et séquence Composition: nom et nombre d'AA constituants la peptide. Séquence: ordre dans lequel les AA sont disposés. Technique de détermination de séquence ( = séquençage) Détermination de la composition en AA Il y a 2 étapes: – rompre les liaisons peptidiques soit par hydrolyse acide totale (Hcl à 6M) mais le problème est que cela détruit le Tryptophane et les Gln et Asn sont transformés en Glu et Asp. Soit on utilise l'hydrolyse alcaline (NaOH à 2 à 4M), on obtient alors un mélange d'AA qu'il faut séparer et identifier. – Séparation des AA et dosage. Détermination de la séquence Ces méthodes font appellent à des réactifs chimique ou à des enzymes. Par ailleurs, elles analysent la chaîne soit par les extrémités (C ou N-ter), soit par l'intérieur de la chaîne. Détermination par l'extrémité N-ter: Technique Chimiques: --> Méthode de Sanger Ici on ne peut identifier que le 1er AA, le reste de la molécule et perdue lors de l'hydrolyse. --> Méthode de Dansylation Mais ici on identifie toujours que le premier AA. --> Méthode d'Edman On peut identifier et doser le PTH-AA1. Cette méthode est dite récurrente car elle conserve la chaîne peptidique, donc on peut refaire la dégradation. => « Dégradation récurrente d'Edman ». Techniques Enzymatiques On fait agir des exopeptidases. Exopeptidase = enzyme qui dégrade les peptides par les extrémités. Il existe donc les aminopeptidase, coté N-ter, mais également les carboxypeptidases, coté C-ter. Détermination par l'extrémité C-ter: Techniques Chimiques: Hydrazinolyse: en milieu anyhdre, en présence d'un réactif hydrazine (NH2 – NH2). Cette hydrazine libère l'AA-Cter. Techniques Enzymatiques: On fait agir des carboxypeptidases. Détermination de la séquence dans son ensemble: Des actions de plusieurs enzymes ou réactifs chimiques de spécificités différentes sont indispensables pour pouvoir fragmenter le peptide en plusieurs endroits. Ces informations, recoupées entre elles permettront de déterminer la séquence globale du peptide. Fragmentation du peptide à l'intérieur de la chaîne: Techniques Chimiques: --> Bromure de Cyanogène Il n'agit qu'au niveau de la Méthionine en coupant la liaison peptidique qui inclut le COOH de cet AA. Il coupe après la Methionine. Celle-ci est alors transformée en Homosérine lactone. --> N-bromosuccinimide Il coupe les liaisons peptidiques incluant le COOH de la Tyr ou du Tryptophane. Techniques Enzymatiques: On fait agir des endopeptidase: protéases qui coupent les protéines au sein même de leur séquence. Leur action est spécifique, cad qu'elles ne coupent qu'à un certain niveau. Coupures des ponts S-S éventuels Celon les cas, on peut-être amenés à rompre les ponts disulfures pour établir la séquence en particulier lorsque le peptide est composé de plusieurs chaînes rattachées entre elles. Cela va permettre de séparer les chaînes afin d'établir spécifiquement leur séquence. Mise en ordre des fragments obtenus: Il est intéressant de déterminer la structure primaire d'un peptide car cela permet d'anticiper sa fonction. Par exemple une succession d'AA hydrophobes suggère un possible encrage de ce peptide dans une membrane biologie. On peut également deviner un site actif enzymatique. Tous les résidus d'une chaîne peptidique n'ont pas la même importance. Certains sont indispensables à la fonction de la protéine, dans ce cas ils sont conservés à travers les espèces. D'autres, moins utiles servent de variabilité entre les espèces. 3. Propriétés physico-chimiques des peptides Propriétés physiques Elles dépend de la nature des AA consécutifs. -> pouvoir rotatoire car C asymétrique. -> absorbe dans l'UV (180 à 230nm) si AA aromatiques, alors absorbe aussi à 280nm = propriété importante lors des dosages. Propriétés chimiques Leur solubilité varie selon leur taille et leur composition en AA. Ils sont amphotères en fonction de leur pH (en fonction de la composition en AA). Capacité de la liaison peptidique de former des complexe avec des cations bivalents, comme le Cuivre Cu2+ par exemple. Ex: réaction de Biuret en milieu alcalin, le cu2+ du Biuret forme un complexe ce qui produit une couleur violette dosable au spectrophotomètre. Il existe le réactif de Folin qui lui est spécifique de la Tyrosine. LA SYNTHESE PEPTIDIQUE EN PHASE SOLIDE L'engouement relatif aux peptides est né dès la fin des années 60, quand est apparu la possibilité de synthétiser chimiquement à façon de grandes quantités de peptides. En effet, l'identification de peptides à activité biologique est à la base du développement de nombreuses thérapies: de nombreux peptides naturels ont été caractérisés et portent des activités biologiques très diverses. Citons par exemple: les hormones, les inhibiteurs d'enzymes, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs, les immunomodulateurs... Le peptide de synthèse est promis à un bel avenir: c'est un outil de choix pour des applications aussi diverses que nombreuses dans les domaines de la biologie moléculaire, de la biochimie, de la médecine, du diagnostic et du développement de vaccins et de nouveaux médicaments Le peptide est, soit utilisé directement pour ses propriétés pharmacologiques, soit pour permettre d'approfondir la compréhension des mécanismes biologiques dans lesquels il intervient. De façon très schématique, les principales applications développées avec les peptides synthétiques ont pour objectif d'imiter les caractéristiques de portions d'une protéine beaucoup plus longue Des petits fragments sélectionnes de la protéine sont synthétisés et testés dans des essais biologiques. Cette approche vise à déterminer les sites actifs des protéines: les sites récepteurs, les sites effecteurs et activateurs, les sites de fixation Les divers sites fonctionnels d'une protéine sont ainsi accessibles. Cependant, alors que l'intérêt du peptide a été validé en recherche, les applications cliniques restent encore limitées Une raison essentielle est leur rapide dégradation in vivo par les peptidases. A contrario, le peptide présente l'énorme avantage de ne pas générer de métabolite toxique. Différentes méthodologies sont utilisées pour le développement de "peptides médicaments" Grâce à la modélisation moléculaire, les acides aminés peuvent être remplacés par des résidus "exotiques", les liaisons chimiques entre résidus peuvent être remplacées par des liaisons résistantes, ce qui permet de conserver les propriétés caractéristiques intrinsèques du peptide tout en augmentant son temps de demi-vie et/ou son affinité pour sa cible. De tels peptides pharmacomodulés seront la voie de développement de médicaments très sélectifs, basés sur les peptides déjà sélectionnés par la Nature. Le développement de vaccins ou de tests diagnostics est un domaine où un très grand nombre de peptides sont utilisés. La pharmacologie est une autre grande consommatrice de peptides: un grand nombre de peptides sont synthétisés et testés pour leur interaction avec un récepteur ou leur capacité à induire une réponse biologique. Les séquences sélectionnées sont alors synthétisées avec diverses modifications guidées par la modélisation moléculaire qui permettent de déterminer les pharmacophores (les structures importantes pour l'activité pharmacologique). La chimie des peptides: toujours un défi Les peptides sont de petits fragments de protéines d'une taille comprise entre 2 et quelques dizaines d'acides aminés. Les résidus d'acides aminés d'une chaîne peptidique sont reliés entre eux par la liaison peptidique, une liaison amide (-CONH-). Ces liaisons sont formées de façon artificielle au cours de la synthèse chimique des peptides. Les difficultés inhérentes à la synthèse peptidique proviennent de la structure même de leurs constituants de base, les acides aminés, qui portent des radicaux aux propriétés physicochimiques très diverses. Il existe 20 acides aminés naturels qui se différencient par leur chaîne latérale R: dimension, forme, charge, capacité à former des liaisons hydrogène, hydrophobicité, et bien sûr réactivité chimique. Pour former la liaison peptidique entre 2 acides aminés successifs dans la séquence désirée, avec le départ d'eau, il faut utiliser un agent de déshydratation. La réalité est pourtant bien différente. Dans une telle réaction le dipeptide AA1-AA2 serait ultraminoritaire dans le mélange réactionnel, pour plusieurs raisons: • Si l'on ne bloque pas la fonction H2N de AA1 et la fonction COOH de AA2, on forme aussi bien AA1-AA2 que AA2-AA1 et encore AA1-AA1, AA2-AA2... • Si l'on ne bloque pas les fonctions réactives éventuellement portées par R1 et R2, il se formera aussi des branchements latéraux de diverses manières. Il est donc nécessaire d'utiliser des groupements protecteurs si l'on veut obtenir un seul produit. Notons que la synthèse chimique des peptides a lieu dans le sens contraire de la synthèse biologique, la raison est fort simple: la nature sait activer la fonction aminé (NH2) lors de la formation des aminoacyltRNA, le chimiste ne sait qu'activer la fonction carboxyle (COOH) par formation d'un ester. Avant de pouvoir synthétiser un peptide, les problèmes à résoudre par les organiciens ont donc été les suivants. • Disposer d'une stratégie d'activation de la fonction -COOH de l'acide aminé à introduire dans le peptide, qui permette des rendements de couplage supérieurs à 99,99%. En effet, le rendement en produit final décroît exponentiellement avec le nombre d'étapes de couplage: si le rendement n'est "que" de 90% à chaque couplage, (ce qui est déjà excellent pour une réaction organique) au 15ème AA, le rendement final sera (0.915) soit 20%. • Disposer de groupements protecteurs des fonctions latérales -OH. -SH, -COOH, -NH2, -HN- (C=N)-NH2, -NH-, et savoir les enlever spécifiquement avec une efficacité proche de 100% à la fin de la synthèse du peptide • Disposer de groupements protecteurs de la fonction -NH2 à engager dans la prochaine liaison peptidique, et savoir les enlever spécifiquement entre chaque étape de couplage, là aussi avec un rendement quantitatif, sans toucher aux protections latérales Ce n'est pas tout: pour arriver au produit final, il faut être capable à chaque étape de couplage de débarrasser le peptide en croissance des réactifs mis en excès, des groupements protecteurs d'aminé clivés, et autres produits indésirables. Deux approches sont utilisables: synthèse en phase liquide, avec purification du peptide entre chaque étape, et synthèse sur support solide (résine polymère) où la séparation se fait par simple rinçage parés les étapes de couplage et de clivage de la protection intermédiaire. Chacune de ces méthodes a ses avantages et inconvénients La synthèse en phase liquide est longue et fastidieuse (au minimum, deux AA par jour) mais elle peut travailler sur des quantités très importantes, de plus la purification intermédiaire garantit du produit final très propre La synthèse sur support solide est beaucoup plus rapide, elle est automatisable entièrement, mais reste limitée en quantité à quelques grammes de peptide par synthèse. Elle est plus exigeante au point de vue des rendements de couplage et déprotection intermédiaires, car l'on conserve sur la résine toutes les ratées de couplage II faut donc des rendements excellents. Il faut aussi disposer d'un support adéquat pour l'élongation du peptide, et être capable de cliver le peptide de la résine en fin de synthèse. La suite de notre propos sera consacrée à la mise en oeuvre de la synthèse en phase solide: Synthèse en phase solide: Dans une série d'articles de 1962 à 1964, R.B MERRYFIELD à posé les bases de cette stratégie, qui s'est depuis très largement imposée Le principe général est depuis resté le même, mais des améliorations techniques à tous les niveaux l'ont rendue très praticable. Le cycle d'addition commence par la déprotection de la fonction aminé du peptide en croissance, puis l'addition de l'AA suivant activé, ce qui donne un peptide protégé augmenté d'un aa, prêt pour un nouveau cycle. La force de la synthèse sur support solide réside dans les lavages. Lorsque le peptide complet est assemblé, le dernier AA est déprotégé, puis les protections latérales sont enlevées et le peptide est clivé du support (ces deux dernières opérations peuvent se faire de façon concomitante) Le peptide libre est purifié, puis caractérisé.